ABORDAGEM MOLECULAR COMO ALTERNATIVA À EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL: AVALIAÇÃO UTILIZANDO PROPÍDIO MONOAZIDA (PMA)

  • Vagner Ricardo da Silva Fiuza Universidade Estadual de Campinas
  • Liane Yuri Kondo Nakada
  • Gabriela dos Reis
  • Luciana Urbano dos Santos
  • Nilson Branco
  • Regina Maura Bueno Franco
  • José Roberto Guimarães
Palavras-chave: Giardia duodenalis, Infecção experimental, PCR

Resumo

O emprego de Propídio Monoazida (PMA) seguido por PCR tem como premissa detectar a viabilidade de organismos por meio da integridade de sua membrana: ao atravessar membranas danificadas (organismos não viáveis), o PMA entra em contato com DNA e esta ligação passa a ser irreversível, impedindo a amplificação do DNA em PCR. O presente estudo visou comparar os resultados obtidos com uso de PMA/PCR com infectividade animal após aplicação de agente desinfetante em água superficial contendo 105 cistos de Giardia duodenalis. Os cistos foram recuperados por filtração em membrana e concentrados por centrifugação. Alíquotas da suspensão contendo aproximadamente 6.750 cistos foram transferidas para tubos Eppendorf: uma das alíquotas foi tratada com PMA (concentração final de 200 µM; fotoativados por 15 minutos) em duplicata, antes da extração de DNA; outra alíquota foi submetida a extração de DNA sem PMA para controle, também em duplicata. Todas as amostras foram submetidas à PCR. A amostra contendo PMA apresentou amplificação com intensidade muito reduzida quando comparada com a amostra sem PMA, indicando que uma elevada quantidade de cistos foi danificada. No ensaio de infectividade animal, 15 camundongos BALB/c Specific Pathogen Free de 28 dias de idade foram inoculados experimentalmente e separados em grupos de cinco animais cada: A, controle positivo; B, com cistos após agente desinfetante; C, controle negativo. Análises histológicas dos intestinos do grupo B revelaram a presença de trofozoítos em quatro, dos cinco animais. Embora um grande número de cistos tenha sofrido danos, é possível que os cistos não afetados pelo tratamento tenham causado infecção, mesmo em baixa quantidade, uma vez que apenas 10 cistos são capazes de causar infecção em hospedeiros suscetíveis. As análises indicam que os resultados obtidos por ambos os métodos foram similares. Recomenda-se a realização de PCR em tempo real para estimativa de cistos íntegros após o tratamento.
Publicado
2016-10-18
Seção
FOTOS - ENCONTRO NACIONAL DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA 2017