EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ENSAIOS DE ATIVIDADE DAS ENZIMAS UCK1 E UCK2 DA VIA DE SALVAÇÃO DE PIRIMIDINAS DO PARASITA Schistosoma mansoni

  • Gabriela Viotto Sarro Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
  • Juliana Torini Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
  • Vitor Serrão Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
  • Larissa Romanello Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
  • José Brandão Diomond Light Source. Harwell Science and Innovation Campus Didcot. Oxfordshire
  • Humberto Pereira Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
Palavras-chave: Schistosoma mansoni, uridina citidina quinase, pirimidinas.

Resumo

O Schistosoma mansoni é o parasita responsável pela esquistossomose, doença que afeta cerca de 258 milhões de pessoas no mundo. A via de síntese e salvação de pirimidinas tem sido citada como um alvo potencial para o desenvolvimento de fármacos. A uridina citidina quinase (UCK), atua na via de salvação de pirimidinas, catalisando a fosforilação de uridina e citidina para seus respectivos monofosfatos (UMP e CMP). As duas isoformas da enzima (UCK1 e UCK2), foram expressas em bactérias a 20 ºC por 16 horas, a expressão foi induzida com 1 mM de IPTG após 4 horas de crescimento. Devido a presença de uma cauda poli-histidina, a purificação foi feita por cromatografia de afinidade em coluna de cobalto. As proteínas UCK1 e UCK2 foram dialisadas, concentradas e submetidas à ensaios cinéticos, que foram analisados por HPLC, utilizando a coluna Supelcosil™ LC-18S. Foram feitos controles para determinação do tempo de retenção da citidina, CMP, ATP, ADP e um Mix com os compostos citados para confirmar a separação dos picos. Para a reação com uridina foi feito o mesmo procedimento usando os controles uridina, UMP, ATP, ADP e o Mix. Não foi observado atividade catalítica para a enzima UCK1, uma vez que não foi detectado a presença do produto após a realização dos ensaios cinéticos. A UCK2 mostrou-se ativa para ambos os substratos, citidina e uridina. A UCK2 não apresenta uma sequência adicional no C-terminal, que está presente na UCK1. Por ser uma proteína putativa, é possível que essa sequência adicional, seja na verdade um erro na predição da sequência proteica, e por tanto, não se trate de duas proteínas e sim de apenas uma. A compreensão da estrutura juntamente com a atividade enzimática, contribuirão para o entendimento bioquímico do parasita e colaborará para o desenvolvimento de futuros inibidores específicos.

Biografia do Autor

Gabriela Viotto Sarro, Instituto de Física de São Carlos - IFSC Universidade de São Paulo - USP
Bioquímica - Departamento de Biologia Estrutural e Cristalografia
Publicado
2016-10-17
Seção
FOTOS - ENCONTRO NACIONAL DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA 2017